Human embryonale Nieren HEK293F-Freestyle (HEK293F) Zellen wurden in Expi293 Expression Medium bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 8% CO2 kultiviert. Menschliche embryonale Nieren (293T) Zellen wurden im Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D6046, Merck, Darmstadt, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum (FB-1365, Biosera, Frankreich) kultiviert. Die verwendeten Plasmide enthielten MARV (Stamm Musoke, GenBank ID YP_001531153.1) und kodierten für Wildtyp-Proteine (pCAGGS-L, pCAGGS-VP30, pCAGGS-VP35, pCAGGS-NP), einen T7-getriebenen MARV-Minigenom, das Renilla-Luziferase kodiert (p3M-5M-Luc), und eine T7-DNA-abhängige RNA-Polymerase (pCAGGS-T7).
Für MARV wurden die HEK293F-Zellen mit pCAGGS-NP (1-395) transfiziert und zur Extraktion und Reinigung des NP-RNA Komplexes verwendet. Für EBOV wurden die HEK293T-Zellen mit pCAGGS-NP (1-450) transfiziert und ähnliche Methoden zur Reinigung angewendet. Eine Negative-Staining-EM wurde durchgeführt, gefolgt von Cryo-EM-Probenpräparation und -datensammlung. Die Cryo-EM-Daten wurden mit RELION3.1 verarbeitet, um ein 3D-Modell des NP-RNA-Komplexes zu erstellen, das eine nominale Auflösung von 3,1 Å aufwies. Das Atommodell des Komplexes wurde durch molekulardynamische Simulation und Bindungsenergieanalyse weiter verfeinert.
Minigenom-Assays wurden für MARV und EBOV durchgeführt, um die Aktivität der Nukleokapsid-Komponenten zu bewerten. Western Blot-Analysen wurden ebenfalls durchgeführt, um die Expression der Nukleokapsid-Proteine nachzuweisen. Molekulardynamiksimulationen und Bindungsenergieanalysen wurden verwendet, um die Wechselwirkungen im NP-RNA-Komplex zu untersuchen. Statistische Analysen wurden durchgeführt, um signifikante Unterschiede in den Assays zu bewerten. Die Forschung wurde sorgfältig dokumentiert und in diesem Artikel ausführlich beschrieben.
